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一、實驗?zāi)康?/span>

1.掌握聚合酶鏈式反應(yīng)的原理。

2. 掌握移液槍和 PCR 儀的基本操作技術(shù)。

二、實驗原理

PCR 技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國 PE Cetus 公司的 Kary Mullis 在 1983 年（1993 年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的 DNA 片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是 DNA 分析常用的技術(shù)，而且在 DNA 重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

PCR 可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的 DNA 為模板產(chǎn)生新的互補 DNA 片段。細胞中 DNA 的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR 是在試管中進行的 DNA 復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細胞內(nèi) DNA 復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。

PCR 由變性 -- 退火 -- 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 94℃左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；

②模板 DNA 與引物的退火 (復(fù)性)：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA 模板 -- 引物結(jié)合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性 -- 退火 -- 延伸三過程，就可獲得更多的 “半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、實驗試劑與器材

模板 DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA 聚合酶（5U/μL）、SSR 引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR 儀、移液槍、PCR 板

四、實驗步驟

1、配制 20μL 反應(yīng)體系，在 PCR 板中依次加入下列溶液：

模板 DNA 2μL

引物 1 1μL

引物 2 1μL

dNTP 1.5μL

MgCl2 2μL

10×buffer 2μL

ddH2O 10μL

Taq 酶 0.5

2、設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序。

3、上樣，啟動反應(yīng)程序。

4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

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