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　　大鼠CD9分子(CD9)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說明書

　　BS-3493大鼠CD9分子(CD9)ELISA試劑盒

　　實(shí)驗(yàn)原理

　　本試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被大鼠CD9分子捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠CD9分子(CD9)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

　　樣本處理及要求

　　血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。

　　實(shí)驗(yàn)操作步驟

　　準(zhǔn)備工作：從冰箱中取出試劑盒，待其平衡至室溫(20-25℃)，確保試劑盒內(nèi)各組分達(dá)到最佳反應(yīng)狀態(tài)。將未使用的板條連同干燥劑一同放回鋁箔袋內(nèi)，密封后保存于4℃冰箱中。

　　加入標(biāo)準(zhǔn)品與檢測樣本：依據(jù)試劑盒說明書要求，選用適宜的溶液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，制備出一系列具有明確濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。使用移液器精準(zhǔn)地將標(biāo)準(zhǔn)品工作液和檢測樣本分別加入到ELISA板的對應(yīng)孔中，每孔加入量嚴(yán)格控制在100μl。將加樣后的ELISA板置于37℃恒溫環(huán)境，避光孵育90分鐘。

　　洗板：孵育結(jié)束后，取出ELISA板，用洗板液以輕柔且均勻的力度輕輕洗滌5次，每次洗滌持續(xù)30秒。每次洗滌后，將洗板液倒出，隨后用吸水紙輕輕拍干板底。

　　加入生物素化抗體工作液：將生物素化抗體工作液準(zhǔn)確加入到每個(gè)孔中，每孔加入量為100μl;對于空白孔，則加入100μl生物素化抗體稀釋液。將ELISA板放回37℃恒溫環(huán)境，繼續(xù)避光孵育60分鐘。

　　加入酶結(jié)合物工作液：將酶結(jié)合物工作液精準(zhǔn)地加入到每個(gè)孔中，每孔加入量為100μl;空白孔則加入100μl酶結(jié)合物稀釋液。

　　注意事項(xiàng)

　　CD9在部分組織和細(xì)胞株系表達(dá)，并且其表達(dá)量在不同組織和細(xì)胞株系也有差別，建議設(shè)置陽性對照。

　　CD9是一個(gè)多次跨膜蛋白，強(qiáng)烈建議提取蛋白時(shí)不煮樣，防止蛋白聚集;表達(dá)量較低的細(xì)胞可通過提取膜蛋白富集靶標(biāo)蛋白。

　　在對外泌體進(jìn)行CD9檢測時(shí)，CD9的蛋白豐度十分重要，若提取的外泌體中CD9含量較低，易出現(xiàn)無信號(hào)現(xiàn)象。

　　CD9是一個(gè)蛋白分子量比較小的蛋白，建議在電泳和轉(zhuǎn)膜時(shí)根據(jù)小分子蛋白操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　注：以上資料僅供參考，具體請咨詢技術(shù)老師。

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